ALBANY MEDICAL COLLEGE

        Albany New York & UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

Tingo María – PERU

Acciones antinflamatorias de la Uña de Gato Uncaria tomentosa (Willd.) DC : rol del NF-kB

Manuel Sandoval Chacón Ph.D.¹,Jane H. Thompson¹, Xiao-Jinh Zhang MD¹, Xiaoping Liu Ph.D.,X. LIU, Elizabeth E. Mannick MD, Halina Sadowska- Krowicka MD, Randi M. Charbonnet¹, David A. Clark MD¹ and Mark. J. S. Miller Ph.D¹

¹ Albany Medical College, Department of Pedriatics Physiology & Cell Biology, Albany, New York 12208, USA Louisiana State University, Escuela de Medicina,Departamento de Pediatría y Centro del Cáncer Stanley S. Scott,

New Orleans, LA 70112, USA  

Correspondencias : Manuel Sandoval Chacón PH.D.

Assistant Professor

Department of Pediatrics, Physiology & Cell Biology  
Albany Medical College  
47 New Scotland Avenue (MC 88)  
Albany, New York 12208}  
E-mail msandoval@ccgateway.amc.edu

Acciones antiinflamatorias de la uña de gato Uncaria Tomentosa (Willd.) DC rol del NF-kB

Manuel Sandoval Chacón Ph.D.¹,Jane H. Thompson¹, Xiao-Jinh Zhang MD¹, Xiaoping Liu Ph.D.,X. LIU, Elizabeth E. Mannick MD, Halina. Sadowska- Krowicka MD,, Randi M. Charbonnet¹, David A. Clark MD¹ and Mark.J.S. Miller Ph.D¹

¹ Albany Medical College, Department of Pedriatics Physiology & Cell Biology, Albany, New York 12208, USA

Louisiana State University, Escuela de Medicina,Departamento de Pediatría y Centro del Cáncer Stanley S. Scott, New Orleans, LA 70112, USA

SUMARIO

Antecedentes:  La Uncaria tomentosa es una planta comúnmente conocida como “uña de gato” (UG) y es utilizada en la medicina tradicional peruana para el tratamiento de una amplia variedad de problemas de la salud, particularmente males digestivos y artriti

Propósito:  El objetivo de este estudio fue determinar las propiedades antiinflamatorias propuestas de la uña de gato.  Específicamente: (i) ¿protege un extracto de corteza de uña de gato contra el estrés oxidativo en estudios in vitro?, y (ii) determinar si la uña de gato modifica eventos regulados transcripcionalmente

Métodos:  LA Mortalidad de células en respuesta al oxidante peroxinitrito (PN, 300 mm) fue determinada en dos líneas celulares, RAW 264.7 (macrófago) y HT29 (epitelial).  Se evaluó la influencia de la uña de gato en: (a) la expresión genética de la enzima sintasa inducible óxido nítrico (iNOS) en HT29, (b) los efectos directos sobre los niveles del óxido nítrico y peroxinitrito, y (c) la activación del factor nuclear -kappa beta (NF-kB) en células RAW 264.7. Para los experimentos in vivo se indujo inflamación intestinal crónica en ratas inyectando indometacina (7.5 mg/kg.) vía subcutánea, y la uña de gato se administró en el agua de beber (5 mg/mL).

Resultados: La administración de UG (100 mg/mL) atenuó significativamente (P < 0.05) la fragmentación del DNA o muerte celular por apoptosis inducida por el oxidante peroxinitrito en HT29 (epitelial) y células RAW 264.7 (macrófago).  La uña de gato inhibió la expresión genética de iNOS inducida por el lipopolisacárido de E. coli (LPS); disminuyó (P < 0.05) la formación de nitritos, mortalidad de las células e inhibió la activación del factor de transcripción NF- kB.  La uña de gato atenuó notoriamente la enteritis inducida por indometacina demostrado por la reducción de la actividad de la enzima mieloperoxidase (MPO), disminución del daño morfométrico y expresión de la metalotioneina hepática.

Conclusiones:  La uña de gato protege contra el estrés oxidativo y negó la activación del factor de transcripción NF-kB.  Estos estudios proveen una evidencia mecanística a la creencia ampliamente mantenida que la uña de gato es un efectivo agente antiinflamatorio.

INTRODUCCION

Entre los numerosos factores asociados a la inflamación intestinal crónica la producción incrementada de oxidantes y radicales libres han sido ampliamente reconocidos como componentes integrales del daño a la célula y el tejido.¹  Agentes que niegan la producción y/o efectos de metabolitos reactivos de oxígeno y nitrógeno han mostrado tener beneficios terapéuticos.^2-4   Los antioxidantes endógenos pueden ser disminuidos durante estados de inflamación crónica, lo que en parte puede explicar la eficacia terapéutica de la mesalamina y glucocorticoides.^5-6  La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa son las dos formas más comunes de enfermedad intestinal inflamatoria.  Aunque la etiología de la enfermedad intestinal inflamatoria permanece imprecisa, cada vez existe más evidencia que sugiere que los oxidantes, radicales libres y la flora bacterial pueden jugar un rol en la patogénesis de la inflamación intestinal.  El excesivo crecimiento bacterial ha sido asociado a una variedad de desórdenes inflamatorios intestinales.⁷  El incremento de la permeabilidad intestinal a los contenidos luminales (bacteriales o dietéticos) puede también promover la inflamación de las mucosas así como afectar los órganos sistémicos, particularmente el hígado.⁸  Se ha reportado que durante estados de inflamación, LPS y citokinas inducen la síntesis de metalotioneina en el hígado.⁹  Las metalotioneinas (MT) son proteínas ricas en grupos sulfidrilo que fijan metales pesados y oxidantes y son consideradas como proteínas de respuesta de fase aguda. 

            Nuestros actuales tratamientos terapéuticos a la inflamación intestinal permanecen inadecuadas.  En los países en desarrollo muchas de las actuales opciones terapéuticas están fuera del alcance financiero de la población general.  Por esta razón estamos evaluando remedios herbales tradicionales en la inflamación intestinal.

            En el presente trabajo hemos usado un extracto acuoso de la corteza seca de la uña de gato Uncaria tomentosa (Willd.)  DC.  La Uña de gato es una planta que pertenece a la familia Rubiaceae, comúnmente conocida como “uña de gato”.  Es una enredadera que crece silvestre en la Amazonía Peruana.  El extracto acuoso y cocimientos de uña de gato son muy usados en la medicina peruana tradicional para el tratamiento de gastritis, artritis y como antiinflamatorio.¹¹  De modo similar, durante los últimos 10 años, la uña de gato en diferentes formas (e.g. extractos, tabletas y cápsulas) ha sido introducida a Europa para tratar a pacientes que sufren de cáncer y algunas enfermedades virales.  Además de las propiedades antiinflamatorias de la uña de gato, sus efectos protectores antimutagénicos también han sido demostrados in vitro contra la fotomutagenesis.¹²  El extracto contiene una mezcla de ácido quinóvico y glucósidos así como también pentacíclico o tetracíclico de alcaloides oxindólicos como teropodina, isoteropodina, especiofilina, uncarina F, mitrafilina e isomitrafilina.^13,14

            El propósito del presente estudio fue:  (i) investigar si el extracto de corteza de uña de gato Uncaria tomentosa (Willd.) DC. es un agente citoprotector in vitro contra el stress inducido por oxidantes en macrófagos de ratoncitos (RAW 264.7) y células epiteliales intestinales humanas (HT29), y (ii) determinar si la actividad antiinflamatoria de la uña de gato involucraba una inhibición de genes regulados transcripcionalmente.

MATERIALES Y METODOS

Materiales

A menos que se afirme de otra manera, todos los químicos fueron al menos grado reactivo y fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).  Todos los reactivos celulares y medios de cultivo fueron de Gibco BRL (Gaithersburg, MD).

Planta y extracción acuosa

La corteza de la uña de gato Uncaria tomentosa (Willd.) DC. fue recolectada en Tingo María, Perú e identificada por el Ing. Raúl Araujo de la Universidad Nacional Agraria de la Selva.  El extracto de Uncaria tomentosa fue preparado de la corteza deshidratada de uña de gato hirviéndola en agua (20 g/L) durante 30 minutos y después dejándola toda la noche a la temperatura ambiental.  El extracto fue decantado y filtrado a 10 mm.  El extracto de uña de gato (UG) para los experimentos de cultivo de células fue filtrado a 0.2 mm y diluido a una concentración final de 5 mg/mL, y después refrigerado.  Para los estudios in vivo el extracto de UG fue filtrado a 0.45 mm.  El extracto contiene alcaloides oxindólicos como la teropodina, isoteropodina, mitrafilina e iso mitrafilina.^{15, 16}

Cultivo de células

Las células HT29 y RAW 264.7 fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (Rockville, MD).  Las células crecieron en glucosa elevada DMEM, 10% FCS y suplementadas con 25 mM HEPES, pH 7.4; 4 mM   L-glutamina; 40 mg/mL penicilina; 90 mg/mL estreptomicina; 0.25 mg/mL fungizona y 1.2 g/L    NaHCO₃.  Los cultivos de células fueron mantenidos en una incubadora CO₂   5% humedecida a 37 °C.  Las células fueron plateadas a 1 x 10⁶  células/mL.  Las células cosechadas fueron plateadas en placas de cultivo de tejido de seis pozos y se permitió que crecieran para confluir después de 24 horas antes del uso.

Síntesis de peroxinitrito

El peroxinitrito (PN) fue sintetizado modificando una metodologa previamente informada.¹⁷  Brevemente, soluciones de (a) 0.7 M  NaNO₂,  0.7 M  H₂O₂   y  (b) 0.6 M  Hcl, fueron bombeados usando una bomba de infusión con jeringa (Harvard Appararus, South Natick, MA) a 25 mL/min., en unión Y-junction y mezclada en un diámetro de 2 mm con un tubo de sílice de 0.5 cm.  La mezcla fue puesta en una cubeta de laboratorio que contenía una solución de KOH  1.5-M.  Para destruir el exceso de H₂O₂, la solución de peroxinitrito fue filtrada en una columna conteniendo MnO₂  (4 g).  La solución preparada contenía 35 - 50 mM peroxinitrito, como lo determinó la absorción a 302 nM (E₃₀₂  =  1670/M/cm).¹⁸  Una solución de peroxinitrito fresco utilizable (5 mM) fue preparada en 5 mM de KOH para cada experimento y filtrado a 0.2 mm.

Viabilidad de la célula

Alícuotas de células tratadas fueron examinadas por viabilidad como determinó la exclusión con tinta azul trypan.  Brevemente, las células HT29 fueron separadas con EDTA trypsin y las células RAW 264.7 fueron raspadas y lavadas con solución salina separada??con fosfato (154 mM,   NaCl;   2.7 mM,   Na₂HPO₄  7H₂O; 1.3 mM, KH₂PO₄), redispersadas en el medio y se agregó 0.4% de mancha azul trypan.  Después de 5 minutos de incubación, la cantidad de células excluyendo el teñido, fue expresada como un porcentaje de células totales contadas de tres cámaras al azar del hemocitómetro.

Medición del nitrito/nitrato

Para estos experimentos, las células Ht29 y RAW 264.7 fueron tratadas con lipopolisacárido (LPS, 1 mg/mL) y/o UG (100 mg/mL) e incubadas por 18 horas y 12 horas, respectivamente.  Los productos finales estables de nitrito/nitrato de óxido nítrico (NO₂ y NO₃) fueron ensayados en las células HT29 y RAW 264.7 usando el reactivo Griess después de la conversión de NO₃   a NO₂) con un equipo de ensayo colorimétrico (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI).

Detección de Apoptosis por ELISA

Las células HT29 y Raw 264.7 fueron tratadas ya sea con 300 mm de PN y/o suplementadas con extracto de uña de gato (UG, 100 mg/mL) e incubadas por 4 horas.  La apoptosis (fragmentación de ADN) fue cuantificada usando la detección de muerte celular ELISA (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) como se describe previamente.¹⁹

Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)

Las células RAW 264.7, a 1 x 10⁶/well, fueron plateadas en grupos de seis pozos y tratadas con LPS (1 mg/mL) y/o UG (50-100 mg/mL) e incubadas a 37 °C.  Después de 2 horas, el medio que cubre las células fue retirado y reemplazado con solución salina ice-cold phosphate-buffered.  Las células RAW 264.7 fueron cosechadas by scraping seguidas de una centrifugación (1000 g). La preparación de los extractos de proteína nuclear y EMSAs fueron llevados a cabo como se informó previamente.^{20, 21}  La concentración de proteína de los extractos nucleares fue determinada usando un equipo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).  Las reacciones obligatorias fueron realizadas con 5 mg de proteína para NF-kB por reacción.  La secuencia consensual del examen NF-KB (el sitio obligatorio está subrayado) fue 5’-AGTT-GAGGGGAGACTTTCCCAGGC-3’ (Promega, Madison, WI).

Evaluación del peroxinitrito purificando con la uña de gato

Muestras diluidas de la solución de stock del peroxinitrito (40 mM) fueron usadas para preparar soluciones de 300 mM de peroxinitrito que contenían 5 mM KOH (pH 12).  El volumen final fue 1 mL. y la absorción a 302 nm fue determinada o escaneada a partir de 200 a 400 nm a 1 y 10 minutos, respectivamente.  Un espectrómetro DU 64 de Beckman (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) fue usado para confirmar el cambio en absorción.  En experimentos separados, la absorción de UG (100 mg/mL) diluida en 5 mM de KOH o reaccionado con 300 mM de peroxinitrito fue escaneado y la absorción a 302 nm fue determinada.

Auto-oxidación del óxido nítrico con extracto de uña de gato

Para ver si el óxido nítrico reaccionaba con el extracto de UG, la depleción dependiente del tiempo de 30 mM de óxido nítrico fue monitoreada en dos soluciones:  (i) solución fosfato (pH 7.4) que contenía 5 mg/mL de extracto de UG, y (ii) solución fosfato son extracto de UG.  Los experimentos de microelectrodo fueron realizados a 25 °C.  La solución de stock saturado contenía 160 mM de óxido nítrico, como fue determinado con la electroquímica (BAS 100 B/W, Sistemas Bioanalíticos, West  Lafayette, IN).  Las condiciones para los experimentos electroquímicos han sido presentadas previamente.²²

Análisis de la expresión genética iNOS por RT-PCR

Las células HT29 2 x 10⁶  células/pozo fueron sembradas en placas de cultivo de tejido de seis pozos e incubadas con LPS (1 mg/mL) y/o UG (50 - 200 mg/mL).  Después de 12 horas, todo el RNA fue aislado a partir de células con el método de extracción del ácido guanidino tiocianato-fenol-cloroformo.²³  La integridad del RNA fue confirmada en un gel agaroso de 1.2% y el RNA fue visualizado con el bromuro etidio.  ADNs complementarios del primer ramal fueron sintetizados a partir de 1 mg del RNA total usando oligo dT y Superscript II Reverse Transcriptase (Ginco BRL, Grand Island, NY).  Los primeros patrones de ramal de ADN fueron amplificados por dehidrogenasa gliceraldehido-3-fosfato  y los iNOS por la reacción en cadena polimerasa (PCR) usando un inicio caliente (Ampliwax, Perkin Elmer, Foster City, CA).  Los patrones para iNOS fueron como se indica a continuación:  enviar 5’- TCG AAA CAA CAG GAA CCT ACC A-3’ (un oligonucleótido de 22 mer en posición 529) y revertir 5’- ACR GGG GTG ATG CTC CCA GAC A-3’ (un oligonucleótido de 22 mer en posicion 1435), originando un producto PCR par de base 907. Estos datos secuenciales están disponibles del GenBank según número de acceso D14051.  Los patrones para el dehidrogenado gliceraldehido-3-fosfato (GADPH) usados como un estándar interno para ratas fueron los siguientes:  enviar 5’ -ATT CTA CCC ACG GCA AGT TCA ATG G-3’  y revertir 5’-AGG GGC GGA GAT GAT GAC CC-3’ (número de acceso del GenBank M17701).  El ciclo PCR fue un paso inicial de 95 °C por 3 minutos, seguido de 94 °C por 30 segundos, 60 °C por 45 segundos, 72 °C por 1 minuto, con 30 ciclos y un ciclo final de 72 °C por 4 minutos.  El control negativo fue una reacción cADN que usaba agua en lugar de RNA.  Productos PCR (iNOS 12 mL, GADPH 6 mL) igualados para dar señales equivalentes a partir del GADPH mRNA, fueron electroforesados mediante 2% de geles agarosos (FMC, Rockland, ME) conteniendo 0.2 mg/mL de bromuro etidio.  Los geles fueron visualizados con luz ultravioleta y fotografiados con película Polaroid (Polaroid Corporation, Cambridge, MA).

Inflamación intestinal inducida por indometacina

Modelos animales de droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID) enteropatía inducida, fueron asociados con cambios en morfología, daño microvascular y cambios en la permeabilidad epitelial.  ^{24, 25}  Para evaluar la actividad antiinflamatoria de la uña de gato sobre el daño intestinal inducido por indometacina, se compró ratas Sprague-Dawley (225-250 g) a Harlan-Sprague-Dawley (Indianápolis, IN) y fueron encerradas en jaulas de acero inoxidable en una habitación controlada ambientalmente (25 °C, en un ciclo de 12 horas/12 horas claro/oscuro).  Se proporcionó alimento y agua ad libitum por 5 días antes del experimento.  Un modelo crónico de inflamación intestinal fue inducido por dos inyecciones s.c. de indometacina (7.5 mg/kg) diarias a un intervalo de 24 horas como lo describe Yamada et al.²⁴  Los animales fueron divididos en cuatro grupos:  (A) grupo de control de vehículo (5% de NaHCO₃), (B) injectados s.c. dos veces al día con vehículo u complementados con uña de gato (US, 5 mg/mL) en agua potable (UG).  Las ratas de los grupos A y B recibieron agua, y todos los animales fueron alimentados con un comida de rata de laboratorio ad libitum.

Actividad mieloperoxidase de tejido

La mieloperoxidase del tejido (MPO) fue cuantificada como un índice de infiltración neutrofila.  Muestras de tejido fueron pesadas, congeladas en nitrógeno líquido y después almacenadas a -77 °C hasta el ensayo.  Los niveles de tejido de la mieloperoxidase fueron determinados modificando una técnica previamente descrita.²⁶

Brevemente, 0.2 g de midjejunum fueron homogenizados por 45 segundos a 4 °C con un homogenizador de tejidos (Virtis, Gardiner, NY) en 2 mL de bromide hexadeciltrimetilamonio (HTAB) en 50 mM de separador de potasio, pH 6.0.  El homogenato fue después sonicado por 10 segundos y fue tres veces congelado y deshielado, luego de lo cual la sonicación fue repetida; las suspensiones fueron luego centrifugadas a 40 000 g  por 15 minutos.  La mieloperoxidase fue medida espectrofotométricamente:  50 mL del supernatant fue mezclado con 1450 mL de 50 mM de fosfato separador, el pH 6.0 conteniendo 0.167 mg/mL dihidrocloro o-dianisidina y 0.0005% H₂O₂.  El cambio en absorción a 460 nm fue medido con un espectrofotómetro Beckman DU 64 (Beckman Instruments, Fullerton, CA).

Determinación del daño intestinal

Un grupo de ratas fue utilizado para una comparación de estudios morfológicos.  Al cabo de 7 días, las ratas fueron anestesiadas y se tomó muestras del midjejunum.  El tejido fue fijado en folmaldehido separado con fosfato,  cubierto en parafina y fueron preparadas secciones de 5 mm.  El tejido fue rutinariamente manchado con hematoxilina y eosina y evaluado con microscopio de luz.

Cuantificación de proteína metalotioneína

Después de 7 días de estudio, los animales fueron sacrificados y se recogió muestras del hígado y células mucosales intestinales para la proteína metalotioneína (MT).  La concentración metalotioneína de fracciones citosólicas del hígado y células intestinales fue determinada con el ensayo de afinidad ¹⁰⁹Cd-Hb, como se describe anteriormente.²⁷

Análisis estadístico

Cada experimento fue realizado al menos tres veces y los resultados están presentados como el medio ± S.E.M..  Se hizo análisis estadísticos usando ANOVA de una vía.  Se hizo una comparación post hoc  de los medios con una prueba de diferencia significante.  Se consideró significante una probabilidad de <0.05.

RESULTADOS

Verificación de viabilidad y apoptosis en las líneas celulares

Se condujo experimentos para examinar los efectos citotóxicos del peroxinitrito (300 mM, por 4 horas), con y sin uña de gato (UG, 100 mg/mL) para delinear el efecto protector del extracto de UG.  La viabilidad de la célula no fue afectada por las condiciones experimentales (Tabla 1). Sin embargo, los resultados indicaron que las células HT29 y RAW 264.7 que reciben 300 mM de peroxinitrito mostraron un incremento importante (P < 0.05) en fragmentos de ADN  citosólicos comparado con su grupo de control decompuesto/peroxinitrito (DC/PN).  En ambas líneas de células, la administración simultánea de 100 mg/mL de extracto de UG y de peroxinitrito resultó en una importante (P < 0.05) reducción del apoptosis (Figuras 1 y 2).  La Tabla 2 muestra el efecto citoprotector del extracto de UG en las células RAW 264.7 tratadas con LPS (1 mg/mL).  De modo similar, la concentración de proteína nuclear fue mayor (P < 0.05) en las células tratadas simultáneamente con LPS y UG que en las células expuestas solo al LPS.

Niveles del nitrito/nitrato 

Las células HT29 tratadas con LPS produjeron mayores niveles de NO₂ /NO₃  (P < 0.05) que las células simultáneamente tratadas con LPS y extracto de UG (Figura 3).  En otro grupo de experimentos con células RAW 264.7, la administración simultánea de uña de gato y LPS causó una inhibición importante (P < 0.05) de 60% de formación de nitrito (Figura 4).

Tabla 1. Viabilidad celular en células HT29 y RAW tratadas con extracto de uña de gato^*

                                                            Viabilidad (%)

* Las células 1 x 10^6/ well fueron sembradas en grupos de seis pozos incubadas toda la noche a 37 °C.

Un extracto fresco de uña de gato (UG) fue preparado para cada e xperimento y filtrado a 0.2 mm.  Los valores son el medio ± S.E.M. de tres experimentos, cada una con tres muestras.

Inhibición de la activación NF-kB con el extracto de uña de gato

La figura 5 muestra el efecto de LPS (1 ug/mL y el extracto de la UG en la activación NF-kB en las células RAW 264.7.  En la presencia de LPS como una fuente de stress oxidativo, la activación de NF-kB fue notoriamente aumentada, compatible con informes anteriores.²⁸  Por otro lado, las células RAW 264.7 tratadas con LPS y extracto de UG (100 ug/mL) causaron una inhibición de NF-kB.

Regulación de iNOS mRNA en células inducidas por LPS

La Figura 6 muestra lo sniveles de la expresión iNOS mRNA a partir de células HT29 tratadas con LPS (1 ug/mL) y/o extracto de UG (50-200 ug/mL).  La expresión de iNOS mRNA fue incrementada en células tratadas con LPS, como fue evidenciado después de una incubación de 12 horas.  Sin embargo, la administración simultánea de extracto de UG y LPS decreció de modo significativo los niveles de iNOS mRNA.  Mientras la expresión del gen GAPDH fue variable en este gel, la reducción en la expresión genética iNOS con UG fue evidente, y fue apoyada por la producción reducida de nitrito/nitrato (Figuras 3 y 4).

Disminución de oxidantes con el extracto de uña de gato

La descomposición del peroxinitrito 9pH 12) en la presencia y ausencia de uña de gato (extracto de UG) fue dirigida espectrofotométricamente a 302 nm.  La adición del extracto de UG (100 ug/mL) al peroxinitrito conteniendo 5 mM de KOH produjo una significativa reducción (P<0.05) en la concentración de peroxinitrito (Figura 7).  La descomposición del peroxinitrito fue evaluada a pH 12 porque el peroxinitrito se descompone rápidamente a pH 7.4.  La absorción del extracto de UG a pH 12 no varió durante el tiempo en que fue evaluado (10 minutos).  Debido a las presiones de tiempo encontradas para cuantificar PN a pH 7.4 (peroxinitrito tiene un periodo de vida medio muy pequeño a pH fisiológico) elegimos seguir la depleción de la absorción del extracto de UG determinado a 245 nm.  Como se esperaba, la absorción del extracto de UG se redujo por la presencia del peroxinitrito (P<0.05) sugiriendo una descomposición o consumo de alkaloides oxindólicos presentes en el extracto de UG con el peroxinitrito.  La Figura 8 muestra la reacción in vitro  del NO, 30 mM con UG, 5 mg/mL y a partir de estos resultados fue claro que el periodo de vida medio del óxido nítrico no fue afectado de modo significativo.

Evaluación de la inflamación intestinal inducida por indometacina

Las ratas tratadas con dos inyecciones s.c. diarias de indometacina produjeron ulceraciones de las mucosas en la parte mesentérica del intestino delgado medio, y también se observaron, al séptimo día después de la inyección, numerosos nódulos blancos localizados a lo largo del lado serosal del intestino.  El grado de inflamación, en el yeyuno medio, estaba asociado con un incremento significativo de MPO en esta sección del tracto gastrointestinal (Figura 9).  Secciones histológicas del yeyuno medio de las ratas que recibieron indometacina (7.5 mg/kg) mostraron una marcada ruptura de la arquitectura de las mucosas, con la pérdida de vellos y una acentuada infiltración de células inflamatorias.  De otro lado, las ratas que recibieron UG (5 mg/mL en el agua potable, (Figura 10) presentaron una arquitectura normal de las mucosas.

La Tabla 3 muestra concentración hepática de metalotionina, un indicador de inflamación.  La metalotionina se incrementó (P < 0.05) en las ratas que recibieron indometacina después de 07 días en comparación con las ratas de control.  La administración de UG (5 mg/mL) en el agua potable para las ratas tratadas con indometacina resultó en una baja (P < 0.05) de metalotionina en el hígado, ni la indometacina ni el extracto de UG afectaron el contenido de metalotionina intestinal.  La inducción de la síntesis de metalotionina en el intestino no depende de la inflamación sino que ocurre como respuesta a metales tales como Zn y Cu. ²⁹

DISCUSIÓN

Los desórdenes inflamatorios se caracterizan por una excesiva producción de radicales libres y especies de oxígeno reactivo y nitrógeno.  Actualmente, la terapéutica empleada a menudo modifica las acciones o producciones de las especies reactivas, y de esta forma se reduce el grado de lesión del tejido.³⁰  Sin embargo, para los países en desarrollo, el acceso a estos agentes terapéuticos puede verse limitado debido a restricciones financieras.  Estas poblaciones tienden a usar medicinas tradicionales, a menudo plantas,  para el manejo terapéutico de las enfermedades.  No obstante, que la cuenca del río Amazonas ha demostrado ser una fuente rica en agentes farmacológicos valiosos, aún queda mucho que hacer sobre el gran potencial para el descubrimiento de drogas dirigidas etnomedicamente.  En este estudio hemos evaluado los beneficios potenciales de una medicina herbal ampliamente utilizada, la uña de gato.  Un extracto acuoso de la corteza de uña de gato anuló la toxicidad celular asociada al peroxinitrito, un poderoso oxidante formado de la interacción de óxido nítrico y superóxido (los radicales precursores de una familia de especies reactivas potentes).  Estos resultados demostraron que el extracto acuoso de uña de gato produce efectos beneficiosos similares a los de un antioxidante, consistentes con descubrimientos previos en los que se empleó extracto metanol de corteza. ³¹ Además, la muerte celular inducida por endotoxina bacterial fue atenuada por la uña de gato.

Hasta ahora, han habido pocos estudios que evalúen los mecanismos de los efectos beneficiosos propuestos de la uña de gato.  Aquí, hemos definido las zonas potenciales.  En primer lugar, la uña de gato degrada directamente el peroxinitrito y atenúa la muerte celular inducida por peroxinitrito, similar a lo que hemos descrito recientemente para la mesalamina.²²  La mesalamina no modifica la degradación oxidativa del óxido nítrico, esto implica que sus propiedades antiinflamatorias no se  interponen a los efectos directos sobre el óxido nítrico, un radical libre relativamente débil. ²²  En cambio, el peroxinitrito, que es altamente reactivo, es una zona de acción.  Se notaron resultados similares con la uña de gato.  Sin embargo, la uña de gato disminuyó el porcentaje de degradación oxidante del óxido nítrico, mientras degradaba directamente el peroxinitrito.   Este es un patrón de efectos que hemos visto también con el ácido ascórbico.³²

Nosotros y otros hemos demostrado las contribuciones de los óxidos de nitrógenos reactivos sobre la inflamación intestinal y la gastritis.^{33, 34}   Además estas especies pueden ser componentes decisivos en el desarrollo de la gastritis y del cáncer gástrico  en respuesta a la infección Helicobacter al píloro que es endémico en Sudamérica.^{35, 36}

El segundo mecanismo por el que la uña de gato puede proporcionar beneficios parece ser el único entre los productos naturales.  La uña de gato, al prevenir la activación del factor transcripcional NF-kB, inhibe la expresión de genes inducibles asociados con la inflamación, específicamente, la uña de gato anula la expresión de la sintasa inducible de óxido nítrico, atenuando así la producción de óxido nítrico.  Juntamente con la degradación directa del peroxinitrito una vez que se ha formado, las consecuencisas citotóxicas de este camino serán ampliamente disminuidas.  Otros caminos pro inflamatorios regulados por NF-kB, pero no investigados directamente aquí (citoquinas, moléculas de adhesión) también deben ser modificados.

La supresión de la proteína de la fase de respuesta aguda inducida por la indometacina, metalotionina, en el hígado, mediante la uña de gato, demuestra que estas respuestas dependientes de la transcripción son registradas in vivo así como in vitro.  Los niveles de letalotionina en el intestino no se vieron alterados por la inflamación inducida por la indometacina ni por la uña de gato.  Este no es un descubrimiento inesperado, dado que la melationina intestinal es regulada casi exclusivamente por los metales pesados, mientras que la expresión hepática de la metalotionina se ve influenciada también por las citoquinas liberadas en estados de inflamación.³⁷   Los glucorticoides pueden anular la inducción de la expresión de iNOS mediante mecanismos transcripcionales, e.g. mediante la inhibición de NF-kB,38 como se ve en este estudio con uña de gato.   Dado que el NFkB controla la expresión de una gran variedad de signos pro inflamatorios, incluyendo las moléculas de adhesión y las citoquinas que no han sido evaluadas aquí,³⁹  resulta razonable asumir que los efectos antiinflamantorios de la uña de gato involucra una reducción generalizada en los mediadores y efectores pro inflamatorios.

Las acciones antiinflamatorias de la uña de gato se registraron en dosis que son consistentes con la práctica de la medicina tradicional.  Además, las ratas evaluadas en el modelo enteritis indometacina fueron tratados con un "té" hecho de un preparado de uña de gato de una forma idéntica al uso etnomédico de la uña de gato en el Perú y en las regiones vecinas.  Esta administración oral del "té" de uña de gato tiene un efecto protector impresionante sobre la enteritis inducida por indometacina en ratas; mormalizando la arquitectura de las mucosas y atenuando la infiltración granulocita.  Este té tiene un sabor agradable y es ampliamente consumido en Sudamérica, y se está tornando más accesible en Norteamérica.  Informes anecdóticos han indicado que es útil en el tratamiento de la inflamación intestinal refractaria.  También es importante notar que los efectos beneficiosos observados en el presente estudio fueron en dosis que no comprometían la función o viabilidad celular.  Por lo tanto, no había indicación de toxicidad.

Existen informes que los ingredientes activos de la uña de gato pueden estar sujetos a variabilidad estacional y regional.¹⁵  Además, existen diferencias entre el uso de la corteza y las raíces.⁴⁰ Sin embargo, también se aprecia que los ingredientes activos propuestos no pueden explicar la conocida eficacia de la uña de gato.⁴¹   Además, no está claro si el actual informe de las propiedades antioxidantes e inhibición transcripcional con este extracto peruano de uña de gato se deben a los ingredientes activos propuestos o a entidades químicas nuevas. La posibilidad de que estructuras químicas nuevas participen en estos efectos antiinflamatorios justifica una continua evaluación de esta hierba medicinal.  Sin embargo, más allá de la investigación de nuevos indicios químicos, este estudio ofrece evidencia definitiva de que los informes anecdóticos de las propiedades de la uña de gato están basados en hechos y son lo suficientemente diversos para ser considerados una importante entidad terapéutica.  La uña de gato se encuentra disponible en la mayoría de países occidentales y se debería evaluar una investigación ulterior en otros modelos de inflamación (gastrointestinal y sistémica) incluyendo estudios clínicos.  Para los países en desarrollo, en los cuales los fondos para el cuidado de la salud son limitados, las hierbas medicinales como la uña de gato merecen ser considerados seriamente.

RECONOCIMIENTOS

Agradecemos la asistencia del Ing. Alberto Silva Del Águila, Rector de la Universidad Agraria de la Selva, Tingo María, Perú, por su asesoramiento y sus útiles exposiciones. Un agradecimiento especial al Ing. Raúl Araujo, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Nacional Agraria de la Selva, Tingo María, Perú, por proporcionarnos las muestras de uña de gato, Uncaria tomentosa.

Este estudio recibió las donaciones de RO1 HD 31885 y PO1 CA 28842 de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD (a M.J.S.M.).

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Figura 9.- Efecto de la uña de gato en la actividad mieloperoxidasa después de la inducción de inflamación intestinal con indometacina.  Las ratas recibieron dos inyecciones de ya sea indometacina o vehículo como se describe en Materiales y Métodos.  Las barras representan la actividad MPO en control, tratamiento con indometacina (indometacina), uña de gato en el agua potable (UG), y tratamiento con indometacina - UG (indometacina = UG).  *Un incremento significativo (P<0.05) en la actividad MPO comparado con indometacina.  Los valores significan + S.E.M. para  el grupo/03 ratas de dos experimentos diferentes.

Tabla 3.- Efecto de la inflamación crónica sobre la concentración de la proteína metalotionina en el hígado e intestino de las ratas*

*           Se indujo la inflamación intestinal crónica con indometacina como se describe en Materiales y Métodos.  El extracto de uña de gato (UG) se administró en el agua potable.  Información de los dos experimento (n = 6).

*          Los niveles de metalotionina (MT) representan medios + S.E.M. medidos mediante ensayo de afinidad 109 Cd-Hb 07 días después de la inducción de la inflamación intestinal con indometacina.  aDisminución significativa (P < 0.05) en MT del hígado comparado con indometacina: b incremento significativo (P < 0.05) en MT del hígado comparado con todos los demás grupos.

Figura 10.- Secciones histológicas del yeyuno medio despues de la inducción de inflamación intestinal con indometacina.  El panel superior:  Tratamiento con indometacina (INDO), vehículo + uña de gato en el agua potable (UÑA DE GATO), e indometacina + uña de gato bebible (INDO + UÑA DE GATO).  Los tejidos se fijaron con parafina, microtono y teñido con hemotoxilina y eosina.