Actividad antimutagénica de un extracto acuoso liofilizado
de Uncaria tomentosa: Un estudio aleatorio a doble
ciego sobre fumadores y no fumadores*

* Se presentaron los hallazgos preliminares de este estudio en el Simposio Macchu Picchu sobre Plantas Medicinales (Urubamba, Perú, 9 de Mayo de 1996 ). Puede dirigirse correspondencia al primer autor.
^a INCAFLORA
^b Laboratorio de Genética, Clínica Ricardo Palma, Av. Javier Prado Este 1066, Lima 27, Perú.
^c Universidad Peruana Cayetano Heredia, Av. Honorio Delgado 430, Lima 25, Perú.
^d Instituto Nacional de Medicina Tradicional, Ministerio de Salud. Av. Salaverry s/n, Lima 11, Perú.

Voluntarios fumadores (n =12) y no fumadores (n =12) asignados aleatoriamente a los tratamientos tomaron 0 diariamente (placebo), o 270 mg de un extracto acuoso liofilizado de Uncaria tomentosa. Se evaluó la actividad mutagénica de su orina siguiendo un diseño a doble ciego con la prueba de Salmonella / con microsoma mamífera (Ames et al., 1975) usando una cepa de prueba S. typhimurium TA 98 con activación metabólica. Los posttests se realizaron los días 17 y 31 del tratamiento, en promedio. Entre los fumadores, la desaparición total de actividad antimutagénica alcanzó su pico en el posttest 1 y dependió de la dosis de tratamiento (r _pb = -.66, p = .01). Habiéndose retirado los efectos placebo estadísticamente, el grado de actividad mutagénica decreció linealmente como una función de la dosis de tratamiento en el posttest 2 (r = -.50, p = .05). La orina de todos los no fumadores tomando U. tomentosa, aunque no toda la de aquellos tomando placebo, no tuvo mutagénesis en los posttests 1 y 2. Estos hallazgos son consistentes con los de Rizzi et al. (1993) y ofrecen apoyo empírico a la hipótesis de que el extracto de la planta inhibe la actividad mutagénica de procarcinógenos y otros mutágenos causados por el humo de cigarrillo.

1. Introducción

Los indios asháninka de la selva peruana usan un extracto acuoso de la raíz o corteza del tallo de la "uña de gato" [Uncaria tomentosa (Willd.) (Rubiaceae)] para el tratamiento del cáncer, la artritis y otras enfermedades (Jones,1996). Algunas propiedades terapéuticas de la planta se pueden atribuir a sus flavonoides; los estudios químicos anteriores identificaron catechin tannins (incluyendo cis-epicatechin) y procianidinas en la corteza (Montenegro et al.,1976). La investigación sobre las actividades biológicas de la U. tomentosa se ha centrado en otros compuestos. Wagner et al. (1985) aislaron alcaloides oxindólicos que mostraron un aumento pronunciado de la fagocitosis. Cerri et al. (1988) aislaron glicósidos de ácido quinóvico que muestran actividades antivirales y anti-inflamatorias (Aquino et al., 1989,1991).

Los resultados publicados de investigaciones relevantes al uso antitumoral de la planta son escasos. Stuppner et al. (1993) informaron sobre los efectos selectivos antiproliferativos de cinco alcaloides oxindólicos de U. tomentosa sobre las líneas de células leucémicas HL60 y U-937. Rizzi et al. (1993), usando la prueba Salmonella / con microsoma mamífera de Ames, informaron que varios extractos y fracciones de la planta mostraron una acción protectora contra la mutagénesis inducida por 8-metoxi-psoralen y radiación UVA en S. typhimurium TA 102. Además, usando cepas de prueba TA 98 y TA 100, encontraron (i) una reducción del nivel inicial alto de actividad mutagénica en la orina de un fumador que tomó un extracto de U. tomentosa obtenido por coción durante 15 días y (ii) ningún efecto sobre el nivel inicial bajo de mutagenicidad observado en la orina de un no fumador.

En la prueba in-vivo, Rizzi et al. (1993) no usaron un placebo como comparación, solamente tenían un caso por celda e hicieron las observaciones de laboratorio con conocimiento del tratamiento al cual estaba sometido cada paciente. El presente estudio, llevado a cabo en el Perú, verificó la acción antimutagénica de la U. tomentosa usando un diseño aleatorio a doble ciego.

2.1. Extracto liofilizado

Se usaron las tabletas de U. tomentosa aprobadas por el Ministerio de Salud del Perú para uso comercial y disponibles en puntos de venta desde 1994.

Cada tableta contenía 90 mg de extracto liofilizado de tallo de 3,000 mg de corteza de tallo virgen. La corteza fue cosechada por indios Piro de la selva central peruana (entre los poblados de Sepahua en el río Urubamba y Atalaya en el río Ucayali, a unos 550 metros sobre el nivel del mar) y se dejó secar a temperatura ambiental durante 4-6 semanas. Los fabricantes obtuvieron el extracto siguiendo una versión de la fórmula asháninka, que consistió en hervir la corteza en agua a 85° C durante 1h 30min. Luego se procesó en la planta liofilizadora de los fabricantes y se convirtió el polvo resultante en tabletas en un laboratorio farmacéutico. El excipiente de las tabletas (70 mg) incluyó fécula de maíz (27.55 mg), lactosa (25.47 mg), goma laca (13.82 mg), aceite de ricino (2.75 mg) y cera carnauba (0.70 mg). El control de calidad rutinario incluyó el análisis microbiológico y cromatográfico. Éste reveló un contenido alcaloide verificado (aproximadamente 0.7% del polvo liofilizado).

El Departamento Farmacológico de la Universidad Peruana Cayetano Heredia llevó a cabo dos estudios en ratones simultáneamente a este estudio. Uno demostró que las tabletas, diluidas en agua y tomadas oralmente, no tenían toxicidad letal, aun en la dosis máxima de 18 g/kg durante 72 horas de observación (Tasayco & Castro de la Matta, 1996). El otro verificó la fuerte actividad anti-inflamatoria, tanto del polvo liofilizado como de las tabletas y confirmó su contenido alcaloide (Castro de la Matta, 1995).

Las tabletas de placebo se hicieron de excipiente (160 mg).

2.2 Sujetos

Se reclutaron voluntarios masculinos y femeninos saludables entre los 18 y los 65 años. De acuerdo a los exámenes médicos, no tenían enfermedades graves y tenían una progenie normal. No usaban vitaminas anti-oxidantes ni drogas psicoactivas que no fueran tabaco o alcohol, no estaban expuestos a mutágenos industriales y mostraron un funcionamiento normal de los riñones y del hígado en las pruebas de sangre y orina. Los fumadores habían fumado de 5 a 40 cigarrillos diarios durante los últimos 5 años. Los no fumadores habían fumado 0 cigarrillos durante los últimos 5 años y no eran fumadores pasivos. Los fumadores con orina no mutagénica y los fumadores con orina mutagénica serían descartados.

El manejo de los sujetos se individualizó y fue consistente con la Declaración de Helsinki. Ellos firmaron un documento de consentimiento informado que describía los objetivos y procedimientos del estudio en detalle, incluyendo la asignación aleatoria y las dosis exactas del tratamiento. Luego fueron sometidos a un chequeo clínico. Si calificaban como donantes saludables se les pedía volver al laboratorio con una muestra de orina de finales de la tarde (pretest) y para recibir los tratamientos. Los posttests se fijaron para los días 15 y 30 del tratamiento, también a finales de tarde. El coordinador del proyecto hacía llamadas recordatorias a los sujetos un día antes y el mismo día de su cita.

2.3 Diseño a doble ciego

Los grupos se procesaron en cohortes de tres dentro de cada grupo (fumadores, no fumadores). Dentro de cada trío hubo una asignación aleatoria a las condiciones del tratamiento, uno por celda, y recibieron una ración de blísters de aluminio de 30 tabletas con la marca registrada MANAXX que reconocieron como una marca de U. tomentosa. Si bien los blísters y las tabletas eran idénticos en apariencia en todas las condiciones experimentales, los primeros variaban en número y las últimas, en contenido. Los sujetos asignados a las condiciones de 90 mg y 270 mg recibieron respectivamente dos y cuatro blísters con tabletas de U. tomentosa, además de las instrucciones de tomar una (aquellos tomando 90 mg) o tres tabletas (aquellos tomando 270 mg) al día con el desayuno. Los sujetos asignados a la condición 0 mg recibieron tabletas de placebo; unos recibieron dos blísters y las instrucciones de tomar una tableta al día con el desayuno y otros recibieron cuatro blísters con la instrucción de tomar tres al día. Los sujetos ignoraron la condición de su tratamiento durante el estudio.

El primer autor del estudio controló los códigos del tratamiento y los depositó donde un notario público antes de recibir algún informe del laboratorio. La segunda autora realizó la prueba de Ames en su laboratorio de genética, sólo en base a la información del código del sujeto, y el tercer autor determinó la creatinina en su laboratorio clínico con información similar, esto es, estuvieron ciegos a los tratamientos a medida que desempeñaban sus tareas.

2.4 Preparación de las muestras de orina

Se compró resina Amberlite XAD (malla 60-150) y dimetil sulfóxido, grado espectrométrico (DMSO) de Sigma (St. Louis, MO, E.U.). El metanol y la acetona tuvieron grado analítico. La resina se preparó tal como lo sugirireron Yamasaki y Ames (1977); se lavó 25 g cinco veces con 150 ml de acetona, cinco veces con 150 ml de metanol y cinco veces con 150 ml de agua Milli-Q. La resina lavada se almacenó a 8° C durante no más de una semana.

Se recogieron las muestras de orina en botellas de plástico de 250 ml en el laboratorio clínico. Se envió parte de la orina inmediatamente al laboratorio de genética para la implementación de la prueba de Ames. La otra parte se usó para determinar las concentraciones de creatinina por medio de la reacción Jaffé.

A su llegada al laboratorio de genética, se congelaron las muestras de orina y se almacenaron a -15° C hasta ser procesadas. La extracción y concentración de mutágenos urinarios se realizó adaptando el método de Yamasaki y Ames (1977). Las muestras de orina se descongelaron a temperatura ambiental, se filtraron a través de papel Whatman no. 1 y se añadieron a columnas de vidrio 7 x 100 mm con 0.90 g de resina lavada/100ml de orina. Grifos de tres salidas Luer regularon la tasa de flujo a 1-2 ml/min. Entonces, la resina se lavó con 10 ml de agua Milli-Q, los mutágenos se extrajeron con 10 ml de acetona y el extracto se fraccionó en dosis de 20 µl y 100 µl. En una plancha de Teflon, se evaporaron los extractos hasta alcanzar una sequedad de 60° C. El residuo orgánico se re-suspendió en DMSO (400 µl /100 ml de orina) para cada estudio de muestra. También se incluyeron dos controles por día, reemplazando una muestra de orina por 9 µl de agua Milli-Q para determinar revertientes espontáneos y la otra con 9 µl de Daunomicina para determinar revertientes inducidos por mutágenos.

2.5 Preparación de homogenado de hígado (mezcla S-9)

La prueba de Ames se ha adaptado para detectar carcinógenos humanos potenciales añadiendo homogenados de hígado de rata directamente a las placas petri, incorporando, por lo tanto, los aspectos esenciales del metabolismo mamífero a la prueba in vitro. La mezcla bifenil policlorinada (Aroclor 1254), la glucosa-6-fosfato (G6P) y el fosfato de nicotinamida adenina dinucleotide y la sal de sodio (NADP) se compró de Sigma (St. Louis, MO, E.U.). La inducción de enzimas de hígado de rata para la activación carcinógena se llevó a cabo en la Universidad Nacional Agraria La Molina siguiendo las sugerencias de Ames et al. (1975). Ratas masculinas de unos 200 g recibieron cada una una sola injección i.p. de Aroclor 1254 (diluido en aceite de maíz a una concentración de 200 mg/ml) a una dosis de 500 mg/kg, 5 días antes de su sacrificio. Se obtuvieron hígados de unos 10 - 15 g y se procesaron a 0 - 4°C usando soluciones frías y estériles y artículos de vidrio. Se colocaron los hígados en una cubeta de laboratorio conteniendo 3 vol. de 0.15 M KCL (3 ml/g hígado húmedo), se picaron con tijeras esterilizadas y se homogeneizaron en un plato caliente para revolver Equatherm de Curting Matheson Scientific, Inc. El homogenado se centrifugó durante 10 minutos a 9000 g (9000 rev/min. en una Microcentrífuga Científica de Fisher) y el sobrenadante (fracción S-9) se decantó y se guardó. 1 ml de fracción S-9 contenía microsoma de unos 250 mg de hígado húmedo. Las fracciones S-9 frescas se esterilizaron con filtros Millipore de 0.22 mm, se distribuyeron en porciones de 2-ml, se congelaron en hielo seco y se almacenaron a - 80° C. Se preparó una mezcla S-9 fresca cada día. Cada ml contenía: S-9 (0.04 - 0.1 ml), MgCl₂ (8 µmol.s), KCl (33 µmol.s), G6P (5 µmol.s), NADP (4 µmol.s) y fosfato de sodio, pH 7.4 (100 µmol.s)

2.6 La prueba de Ames

En la prueba de Ames, las cepas de prueba de S. typhimurium se revierten de un requerimiento de histidina a la prototrofía con mutágenos causados por el humo del cigarrillo y otras fuentes. Para este estudio se seleccionó la cepa de prueba de S. typhimurium TA 98, gentilmente ofrecida por el Dr. B. N. Ames, puesto que demuestra la sensibilidad más alta a los concentrados de orina de los fumadores de cigarrillos. (Yamasaki y Ames, 1977; Putzrath et al., 1981; Recio et al.,1982). La cepa de prueba se examinó para hallar deoxicolado de sodio y sensibilidad al cristal violeta, sensibilidad a la luz UVA y resistencia a la ampicilina. La prueba de Ames se implementó de acuerdo a los procedimientos descritos por Maron y Ames (1983) y De Méo et al. (1988). Se hizo crecer la bacteria de prueba a 37° C durante toda la noche en Nutriente Oxoide caldo no.2. Después de este período de incubación, se añadieron los siguientes ingredientes a los tubos de polistereno estériles de 12 x 75 mm sobre hielo: 0.1 ml de mezcla S-9, una dosis de concentrado de orina (o compuesto de control) no excediendo 10 µl y 0.1 ml del cultivo de toda la noche. Se incubó esta mezcla durante 60 min a 37°C con una rápida sacudida. Después del período de contacto, se colocaron los tubos sobre hielo, sacando uno a la vez y se añadió 2 ml de agar de superficie fundida, 0.2 ml de L- histidina y 0.2 ml de Biotin. Luego, la mezcla combinada se echó sobre las placas petri (estilo 100 x 15 mm, Plásticos Falcón) conteniendo 30 ml de medio de agar de mínima glucosa. Las placas sembradas se incubaron durante 48 h a 37° C en la oscuridad. Siguiendo el período de incubación, se contó el número de revertientes observados en cada placa.

3. Resultados

Hubo seis celdas en el diseño de dos factores en el estatus de fumadores (fumadores, no fumadores) y por tratamientos (0, 90 y 270 mg de U. tomentosa). Los casos útiles para este estudio fueron los primeros cuatro por celda que completaron el tratamiento de un mes y que tenían datos completos sobre todas las variables dependientes en cada fase de medición ( pretest, posttest 1, posttest 2). Se descartaron datos de ocho casos puesto que no cumplieron con este requisito (1 tratamiento descontinuado debido a la presencia de sangre en la muestra de orina, 3 ofrecieron poca orina u orina contaminada y 4 desertaron debido a obligaciones de viaje, problemas de horario o la prohibición de la familia de continuar en el estudio).

Pocos sujetos pudieron donar muestras de orina para los posttests 1 y 2 exactamente los días 15 y 30 del tratamiento puesto que el laboratorio está cerrado los días sábado y domingo y esto, además de la menstruación y obligaciones de viaje, impusieron citas adelantadas o retrasadas. El promedio para los 12 fumadores y los 12 no fumadores y 24 sujetos, los días de tratamiento efectivo fueron, respectivamente, 17.23, 16.50 y 16.88 hasta el posttest 1 y 32,57, 30.25 y 31.42 hasta el posttest 2.

Para probar la hipótesis de este estudio en relación a la acción antimutagénica de U. tomentosa, definimos la actividad mutagénica por (i) el número de revertientes observados > 0 en cada concentrado de orina y (ii) el número mayor de revertientes en 100 µl que en los concentrados 20 µl.

3.1 Inhibición total de mutagenicidad

En el grupo de fumadores, todos los casos mostraron actividad mutagénica en el pretest. Bajo tratamiento, cuatro redujeron el número de revertientes observados a 0 y esto también ocurrió en los concentrados 20 µl y 100 µl. Este fue un resultado inesperado, ya que Rizzi et al., (1993) informaron sobre números de > 0 para el fumador y el no fumador de su estudio in vivo antes y después del tratamiento y (ii) en nuestro propio estudio, el agua Milli-Q generó revertientes espontáneos en todos los casos.

La distribución de casos con revertiente 0 en todos los grupos de tratamiento fue desigual. Mientras que todos los sujetos con placebo mantuvieron conteo > 0 en los posttests, sólo el 75% de aquellos tomando 90 mg de U. tomentosa y 25% de aquellos tomando 270 mg lo mantuvieron así (Cuadro 1). Con el cambio de condición (conteo pretest > 0, conteo posttest = 0) codificado -1 y la falta de cambio codificado 0, obtuvimos una correlación biserial entre esta variable nominal y la dosis de tratamiento, (0, 90 ó 270 mg) ya sea en el posttest 1 o en el posttest 2 (r_pb = -.66, p = .01. de una cola, n = 12). Por lo tanto, los datos rigurosos de este estudio en relación a la inhibición completa de la mutagenicidad fueron consistentes con la hipótesis de que U. tomentosa inhibe la actividad mutagénica.

3.2 Grado de Inhibición

Los datos nominales del Cuadro 1 sugieren que los efectos fueron similares con 17 ó 33 días de tratamiento. Sin embargo, un análisis del grado de inhibición mutagénica sugiere una conclusión diferente. La Tabla 1 ofrece el número promedio de revertientes observado

por grupo de tratamiento y concentrado de orina en cada fase de medición. El Cuadro 2 ilustra el cambio promedio en el número de revertientes del pretest a cada posttest. La correlación Pearson entre el puntaje de cambio y la dosis de tratamiento en los 12 casos ofrece un índice cuantitativo sintético de los efectos del tratamiento. Bajo el concentrado de orina 20 µl, la correlación para el posttest 2 estuvo muy cerca de tener significancia (r =-.47, p = .11). Por lo tanto, los datos sobre el grado de inhibición mutagénica mostraron mayor efecto de la U. tomentosa después de 33 días de tratamiento que después de 17 días de tratamiento.

3.3 Efecto placebo

Se evidencia un efecto placebo en los números disminuyentes de revertientes observados del pretest al posttest 1 y luego al posttest 2 en el grupo tomando 0 mg de U. tomentosa (Tabla 1, Cuadro 2). Los cambios en la sensibilidad de la prueba de Ames no pueden explicar esta tendencia. Como lo muestra la Tabla 2, el número de revertientes espontáneos (como respuesta al agua Milli-Q) permanecieron aproximadamente constantes y el número de revertientes inducidos por mutágenos (causados por la Daunomicina) se incrementó. Los cambios en la concentración de las muestras de orina también se pueden descartar puesto que las concentraciones de creatinina fueron mayores en el posttest 2 que en el pretest.

Esto presenta el sesgo del observador como la causa más probable del efecto placebo, ya que los analistas genéticos estaban ciegos a las dosis del tratamiento, aunque no totalmente ciegos a la fase de medición, y por lo tanto podrían haber tendido a contar mayor número de revertientes en los pretest que en los posttest. Si hubiese un sesgo del observador asociado a la fase de medición, los datos para los casos tomando U. tomentosa también podrían estar sesgados. Sin embargo, si esta tendencia opera aproximadamente como una constante y afecta por igual el conteo de diferentes concentraciones de orina, podría controlarse estadísticamente.

Ames et al. (1975) sugirieron confirmar la actividad mutagénica demostrando un efecto de respuesta a la dosis para un rango estrecho de concentraciones del sospechado carcinógeno y De Méo et al. (1988) usaron un enfoque de regresión para medir la actividad mutagénica. Computamos la pendiente de regresión del número de revertientes de concentrados de orina (20 µl, 100 µl) por placa para cada caso en cada fase de medición (coeficiente b) asumiendo que el sesgo del observador afectaba la altura de la regresión (coeficiente a) mas no su pendiente. En efecto, el cambio promedio en la pendiente del pretest al posttest 2 estaba virtualmente libre del efecto placebo (Cuadro 3) y la correlación entre el cambio en la pendiente y las dosis de tratamiento alcanzaron significancia (r = -.50, p = .50). Por otra parte, el efecto placebo no se retiró completamente del cambio promedio en la pendiente del pretest al posttest 1 y la correlación entre el cambio en la pendiente y la dosis de tratamiento no llegó a tener significancia (r = -.19, p = .28).

3.4 Sensibilidad de la prueba de Ames y concentración de las muestras de orina

La sensibilidad de la prueba de Ames y la concentración de las muestras de orina variaron en los grupos de tratamiento (Tabla 2); sin embargo, no pueden ofrecer alternativas verosímiles a la hipótesis de que la dosis de U. tomentosa causó la inhibición total de actividad mutagénica observada en el posttest 1. Para facilitar las comparaciones entre las variables de diferente medida, el Cuadro 4 ilustra los cambios porcentuales computados sobre la base de datos de la Tabla 2. El panel izquierdo del cuadro nos muestra cambios casi idénticos en cada variable para los grupos de tratamiento 0 y 270 mg. Por tanto, estas variables no pueden ser responsables de la correlación observada entre dosis de tratamiento e inhibición total de mutagenicidad después de 17 días de tratamiento (Cuadro 1).

Los datos hacia el lado derecho del panel del Cuadro 4 son relevantes a las correlaciones observadas entre las dosis de tratamiento y el grado de inhibición mutagénica después de 33 días de tratamiento (Cuadros 2 y 3). El número de revertientes espontáneos se mantuvo constante para el grupo tomando placebo (puntaje de cambio = 0) pero decreció para los dos grupos tomando U. tomentosa, mientras que las concentraciones de creatinina aumentaron más en los sujetos tomando 270 mg que en aquellos tomando 90 mg. Una combinación de sensibilidad de prueba (tal como fue indexado por el número de revertientes espontáneos) y concentración de orina, en lugar de la dosis de U. tomentosa, podría haber causado la mutagenicidad decreciente observada para 0, 90, y 270 mg. Para evaluar esta posibilidad, transformamos cada variable relevante a log. 10 (Variable + 0.0001) y calculamos la actividad mutagénica controlando la sensibilidad de la prueba de Ames ( tal como fue indexado por el número de revertientes espontáneos) y creatinina como:

MA_T = (Revertientes observados_T - Revertientes espontáneos _T)/Creatinina_T.

La correlación entre las dosis de tratamiento y el cambio en MA_T era significativo con ambos concentrados, tanto el 20 µl (r = -.60, p < .03) como el 100 µl (r = -.63, p = < .02). El cambio en la pendiente de la regresión de MA_Ts en concentrados de orina también se correlacionaron significativamente con la dosis de tratamiento (r = -.63, p = < .02). Por lo tanto, las diferencias en la sensibilidad de la prueba de Ames (tal como fue indexado por el número de revertientes espontáneos) y la concentración de creatinina se pueden descartar como causas alternativas de los hallazgos concernientes al posttest 2.

3.5 Variables de donantes

Se observaron diferencias en las características personales y el comportamiento de los grupos de tratamiento (Tabla 3). Sin embargo, ninguna de estas variables se correlacionó significativamente con el cambio en la actividad mutagénica del pretest al posttest 1 o al posttest 2. La edad se distribuyó de una manera monotónicamente ascendente para los tres grupos de tratamiento pero la diferencia de edad entre los donantes con 90 mg y 270 mg de U. tomentosa era trivial y no pudo generar una explicación alternativa para los hallazgos sustantivos de este estudio. El caso del número efectivo de días de tratamiento hasta el posttest 2 es similar.

3.5 No fumadores

Los 12 no fumadores de este estudio mostraron conteos revertientes = 0 ambos con concentrados de 20 µl y 100 µl en el pretest y todos los casos tomando U. tomentosa (n = 8) mantuvieron esta condición en ambos posttests. Este hallazgo es consistente con aquél de Rizzi et al. (1993), quienes en su ensayo in vitro hallaron que la U. tomentosa no causaba mutagenicidad y en su prueba in vivo encontraron que la orina de un no fumador no se hacía mutagénica siguiendo el tratamiento con el extracto de la planta.

Sin embargo, dos casos con placebo mostraron conteos > 0 en el posttest 1 y esto se observó con cada concentrado (Caso # 15, 21 rev. con 20 µl, 54 rev. con 100 µl. Caso # 16 con 11 rev. con 20 µl, 16 rev. con 100 µl.). Los cambios en la sensibilidad de la prueba de Ames o en la concentración de la muestra de orina no pueden explicar este resultado (Tabla 4). Ni tampoco lo pueden hacer las diferencias entre las características personales o el comportamiento de los donantes (Tabla 5). El número pequeño de casos por celda no permite la inducción de conclusiones confiables de este resultado pero el hallazgo sugiere la hipótesis de que la U. tomentosa podría proteger a los no fumadores contra una mutagenicidad temporal.

4. Discusión

Además de nuestro uso de un grupo tomando placebo, un diseño a doble ciego y un número de sujetos en cada celda, hubo otras diferencias metodológicas entre este estudio y la prueba in vivo de Rizzi et al.(1993). (i) Debido a limitaciones de recursos y carga de trabajo, no usamos una cepa de prueba TA 100, b-glucoronidase ni un tercer concentrado de orina intermedio en la prueba de Ames. El nuestro no fue una réplica exacta del estudio de Rizzi et al. (ii) Ellos, a su vez, no informaron sobre el número de revertientes espontáneos, no controlaron los revertientes por mutágenos inducidos ni concentraciones de creatinina (iii) Rizzi et al. pueden haber logrado una implementación más sensible de la prueba de Ames. En nuestro estudio, el número de revertientes observados con 20 µl fue, en promedio, muy bajo entre los fumadores (no mayor que el número de revertientes espontáneos) y para nosotros fue fácil hallar 12 no fumadores que cumplieran el requisito de 0 revertientes en los concentrados de orina 20 µl y 100 µl en el pretest. (iv) Nuestro tratamiento duró un mes, mientras que el de ellos duró solamente 15 días. (v) Finalmente, nosostros usamos una dosis diaria de extracto liofilizado obtenido de 3,000 mg de corteza de U. tomentosa, además de una dosis diaria triple, mientras que Rizzi et al. usaron un extracto fresco de 6,500 mg y los procedimientos para obtener los respectivos extractos estuvieron muy lejos de ser idénticos.

No obstante, los resultados fueron esencialmente similares. Por lo tanto, podemos afirmar confiadamente no sólo que nuestros datos confirman la validez interna de los hallazgos de Rizzi et al. (1993) y apoyan su conclusión de que U. tomentosa inhibe la actividad mutagénica en la orina de los fumadores si no que estos hallazgos también son bastante robustos y fáciles de imitar bajo condiciones variadas.

Quedan algunas dudas acerca de la efectividad relativa de los 17 días versus los 33 días de tratamiento. Mientras que los datos sobre la inhibición total de mutagenicidad sugieren que el tratamiento de más de dos semanas no causa efectos adicionales, los hallazgos relativos al grado de inhibición claramente indican una ventaja para el tratamiento prolongado. Damos más crédito a este último, ya que surgió después de retirar los efectos placebo que atribuimos al sesgo del observador. A pesar de ello, recomendamos precaución en la interpretación de la diferencia entre los dos períodos, ya que podría representar un artefacto de problemas de calibración en la implementación de la prueba de Ames. La única conclusión sólida del estudio es que U. tomentosa inhibe la mutagénesis urinaria en los fumadores. El uso de la prueba de Ames en estudios futuros para hallar el período de tratamiento más efectivo está perfectamente justificado.

Sin embargo, creemos que las futuras investigaciones deberían centrarse más directamente en las implicaciones clínicas de los hallazgos de Rizzi et al. (y los nuestros). La actividad antimutagénica de la U. tomentosa podría deberse a un mecanismo antioxidante que actúa inhibiendo radicales oxidativos/libres mediadores de la transformación de procarcinógenos que están presentes en el humo del cigarrillo (Rizzi et al. 1993, p.76). Una implicación de esta hipótesis es que el extracto de la planta puede prevenir el cáncer asociado a fumar cigarrillos (boca, laringe, esófago, pulmón, páncreas, riñón y vesícula). Investigaciones futuras podrían verificar este potencial a través de pruebas clínicas específicas. Los estudios de largo plazo, de 5 a 10 años de duración, podrían tener como requisito demostrar que los sujetos libres de síntomas tomando U. tomentosa demoran más para desarrollar tumores clínicamente visibles, o desarrollar menos tumores que los sujetos tomando placebo o tratamientos alternativos. En un marco más corto, la investigación podría probar si el tratamiento con el extracto de la planta reduce el número de células precursoras e inhibe su transformación en células malignas. Las células precursoras del tejido de la vesícula son fácilmente detectables en la orina humana.

Por otra parte, esto no debería excluir la investigación sobre el potencial de los extractos de la planta para prevenir otros cánceres. Durante siglos, los indios asháninka no fumaron cigarrillos, sin embargo, usaron y aún usan el extracto acuoso de la "uña de gato" para tratar diversos tumores. De hecho, estudios in vitro no publicados realizados en el Centre National de la Recherche Scientifique de Francia (L’Institut de Chimie des Substances Naturelles) (Villanueva, 1996), en las universidades italianas de Nápoles y Palermo (Pizza, 1996) y para el Northeastern Ontario Regional Cancer Research Centre de Canadá (Cano, 1996) han demostrado la acción citostática de extractos de U. tomentosa en líneas de células cancerígenas de mama. Estudios clínicos in vivo deben seguir esto.

5. Bibliografía

Ames, B.N., McCann, J., and Yamasaki, E. (1975) Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/ mammalian microsome mutagenicity test. Mutation Research 31, 347-364.

Aquino, R., De Feo, V., de Simone, F., Pizza, C., and Cirino, G., (1991) Plant

metabolites, new compounds and anti-inflammatory activity of Uncaria tomentosa. Journal of Natural Products 54, 2, 453-459.

Aquino, R., de Simone, F., Pizza, C., Conti, C., and Stein, M.L. (1989) Plant Metabolites, structure and in vitro antiviral activity of quinovic acid glycosides from Uncaria tomentosa and Guettarda platypoda. Journal of natural Products 52, 4, 679-685.

Cano, P. (1996) Comunicación personal a F.R. León. Lima: INCAFLORA, 28 de Mayo 1996.

Castro de la Mata, R. (1996) Informe oral a F. R. León con respecto al contenido alcaloide y la actividad antiinflamatoria del polvo liofilizado y tabletas MANAXX y cápsulas de Uncaria tomentosa. Lima : Universidad Peruana Cayetano Heredia, 14 de Diciembre, 1995.

Cerri, R., Aquino, R., de Simone, F., and Pizza, C. (1988). New quinovic acid glycosides from Uncaria tomentosa. Journal of Natural Products 51, 257-261.

Jones, K. (1996) Cat’s Claw: Healing Vine of Peru. Seattle, Washington : Sylvan Press.

Maron, D.M., and Ames, B.N. (1983) Revised Methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 113, 175-215.

De Méo, M.P., Miribel, V, Botta, A., Laget, M., and Duménil, G. (1988) Applicability of the SOS Chromotest to detect urinary mutagenicity caused by smoking. Mutagenesis 3, 277-283.

Montenegro de la Matta, S., delle Monache, F., and Marini-Berttolo, G.B. (1976) Alcaloids and procyanidins of an Uncaria sp. from Peru. Il Farmaco31, 527-535.

Pizza, C. (1996) Comunicación personal a F. R. León y F. Cabieses. Urubamba: Hotel Valle Sagrado de los Incas, 10 de Mayo de 1996.

Putzrath, R.M., Langley, D., and Eisenstadt, E. (1981) Analysis of mutagenic activity in cigarette smokers’ urine by high performance liquid chromatography. Mutation Research 85, 97-108.

Recio, L., Enoch, H.G., and Hannan, M.A. (1982) Parameters affecting the mutagenic activity of cigarette smokers’ urine. Journal of Applied Toxicology 2, 241-246.

Rizzi, R., Re, F., Bianchi, A., De Feo, V., de Simone, F., Bianchi, L., and Stivala, L.A. (1993) Mutagenic and antimutagenic activities of Uncaria tomentosa and its extracts. Journal of Ethnopharmacology 38, 63-77.

Stuppner, H., Sturm, S., Geisen, G., Zillian,U., and Konwalinka, G. (1993) A differential sensitivity of oxindole alkaloids in normal and leukemic cell lines. Planta

Medica 59, Supplement Issue A583.

Tasayco, R., and Castro de la Matta, R. (1996) Protocolos No. PO1492/96 y PO1493/96. Lima: Servicio de Control de Calidad de la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

Villanueva, V.R. (1996) Carta via fax a F.R. León desde Gif, Francia, 26 de Febrero de 1996.

Wagner, H., Kreutzkamp, B., y Jurcic, K. (1985) Die Alkaloide von Uncaria tomentosa und ihre Phagozytose-steigernde Wirkung. Planta Medica 44, 419-423.

Yamasaki, E., and Ames, B.N. (1977) Concentration of mutagens from urine by absorption with the non polar ersin XAD-2: cigarrette smokers have mutagenic urine. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 74, 3555-3559.